Paradoks citalopramu: niskie dawki silniej zmieniają ekspresję genów

Citalopram, selektywny inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI), jest powszechnie przepisywany w leczeniu depresji i innych zaburzeń psychicznych. Wraz ze wzrostem jego stosowania rośnie również ryzyko niezamierzonej ekspozycji – zarówno u ludzi, jak i w środowisku naturalnym. Około 12–23% przyjętego citalopramu jest wydalane w niezmienionej formie, co prowadzi do jego obecności w ściekach (0,1–1 µg/L) oraz wodach powierzchniowych (1–100 ng/L) na całym świecie. Związek wykryto również w organizmach wodnych, co potwierdza jego szeroką dystrybucję środowiskową.

Serotonina odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym, regulując procesy takie jak proliferacja komórek, migracja neuronów czy wzrost aksonów. Zaburzenia szlaków serotoninergicznych w tym okresie mogą prowadzić do wad rozwojowych i długoterminowych zmian behawioralnych. Dotychczasowe badania koncentrowały się głównie na ciągłej ekspozycji na citalopram, co utrudniało rozróżnienie między efektami przejściowymi a trwałymi. Nowe badanie wypełnia tę lukę, analizując konsekwencje krótkiej ekspozycji w bardzo wczesnym stadium rozwoju, po której następuje okres bez kontaktu z lekiem.

Jak zaprojektowano eksperyment rozwojowy?

Badacze z Montana State University zastosowali model zebrafish (Danio rerio), który jest uznawany za doskonały organizm modelowy do badania wpływu substancji toksycznych na rozwój. Pierwsze 24 godziny rozwoju zebrafish są wysoce porównywalne do pierwszego miesiąca ludzkiej ciąży pod względem procesów embriogenezy.

Embriony zebrafish eksponowano na citalopram w zakresie stężeń od 0,03 do 250 µg/L (odpowiadających poziomom środowiskowym, ściekowym, terapeutycznym i superterapeutycznym u ludzi) od 2. do 24. godziny po zapłodnieniu (hpf). Po tym czasie embriony dokładnie płukano i przenoszono do środowiska wolnego od leku, gdzie rozwijały się do 48 hpf. Następnie przeprowadzono sekwencjonowanie RNA całych embrionów (RNA-seq) w celu identyfikacji trwałych zmian transkryptomicznych.

Kluczowym elementem projektu było zastosowanie przerwy bez ekspozycji przed pobraniem materiału – dzięki temu możliwe było wyodrębnienie zmian utrzymujących się od tych wynikających z bezpośredniego, ostrego działania citalopramu. Każda grupa liczyła 5 powtórzeń biologicznych po 50 embrionów, co zapewniło odpowiednią moc statystyczną analizy.

Jakie zmiany molekularne wykryto po ekspozycji?

Analiza RNA-seq ujawniła złożony, nieliniowy wzorzec odpowiedzi na różne dawki citalopramu. Przy dawce 0,03 µg/L zidentyfikowano 209 różnicowo ekspresjonowanych transkryptów (DETs), z czego 189 było nadekspresjonowanych, a tylko 20 obniżonych. W dawkach pośrednich (0,9 i 50 µg/L) liczba DETs drastycznie spadła odpowiednio do 13 i 11, przy czym zmienił się również kierunek zmian – w dawce 0,9 µg/L dominowała downregulacja (stosunek up/down wynosił 0,4:1).

Najwyższa dawka (250 µg/L) spowodowała ponowny wzrost liczby DETs do 28, z przewagą nadekspresji (stosunek 4,6:1). Taki hormetyczny wzorzec odpowiedzi sugeruje złożone mechanizmy regulacyjne, prawdopodobnie związane z aktywnością autoreceptorów serotoninowych oraz ich desensytyzacją w odpowiedzi na różne stężenia serotoniny.

Analiza wzbogacenia zestawów genów (GSEA) wykazała, że niezależnie od dawki, konsekwentnie downregulowane były geny związane z funkcją synaptyczną i neurotransmisją. Dotyczyło to m.in. genów kodujących: neuronalną kadherynę (cdh2), podjednostki receptorów glutaminianowych NMDA (grin1a, grin2ca), kanały potasowe (kcnc1a, kcnma1a) oraz transportery glutaminianu (slc17a6b).

Czy citalopram wpływa na metabolizm komórkowy?

Przy najniższej dawce (0,03 µg/L) obserwowano wzbogacenie szlaków metabolicznych związanych z fosforylacją oksydacyjną, cyklem TCA oraz metabolizmem glicyny, seryny i treoniny. Upregulowane były geny kodujące kluczowe komponenty łańcucha oddechowego mitochondriów, w tym: atp8 (syntaza ATP), cox2 (kompleks IV), ndufa1 (kompleks I) oraz enzymy cyklu Krebsa (pcxa, idh3g, mdh1aa).

W wyższych dawkach (50 i 250 µg/L) profil zmian przesunął się w kierunku odpowiedzi stresowej i procesów apoptotycznych. Wzbogacone zostały szlaki związane z metabolizmem glutationu, ferroptazą (żelazo-zależną śmiercią komórki) oraz metabolizmem kwasu arachidonowego. Przy dawce 50 µg/L upregulowane były geny związane z apoptozą, takie jak tp53, tp63, dap, mcl1b i ctslb. Przy dawce 250 µg/L zestaw genów apoptotycznych obejmował map3k5, birc2, actb1, bcl2l1, lmna i jun.

Równolegle wzbogacone były terminy związane z odpowiedzią na toksyczne bodźce i stresem oksydacyjnym, z udziałem genów takich jak gpx4a (peroksydaza glutationowa), mgst3b (transferaza glutationowa), ptgs2a (syntaza prostaglandyn) oraz chac1 (regulator transportu kationów związany ze stresem retikulum endoplazmatycznego).

Jakie struktury rozwojowe są szczególnie wrażliwe?

Analiza wykazała istotne zmiany w genach związanych z rozwojem plakod ektodermalnych, szczególnie plakody soczewkowej oka. Przy dawce 0,03 µg/L stwierdzono silną nadekspresję wielu genów krystaliny gamma 2d (crygm2d1, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 18, 19) – białek strukturalnych komórek włókien soczewki. Wszystkie te geny osiągnęły wyniki wzbogacenia powyżej 2.

Termin “rozwój plakody ektodermalnej” był wzbogacony przy dawce 0,03 µg/L, głównie za sprawą nadekspresji pax2a (regulator rozwoju układu nerwowego, w tym oka i ucha) oraz genu stm (kluczowy dla rozwoju ucha wewnętrznego i układu sensorycznego). Równocześnie obserwowano upregulację zestawu genów “trimer kolagenowy” (kolageny I, IV i VII) przy dawkach 0,03 i 50 µg/L, wraz z downregulacją genów związanych z adhezją międzykomórkową (cntn3a.1, pcdh1, pcdh2).

Zaburzenia w składzie macierzy zewnątrzkomórkowej i molekułach adhezyjnych mogą naruszać strukturę komórek włókien soczewki i zwiększać ich podatność na apoptozę. Wcześniejsze badania wykazały, że ekspozycja na SSRI jest związana z komplikacjami okulistycznymi, prawdopodobnie poprzez szlaki apoptotyczne w komórkach włókien soczewki. Dane z obecnego badania sugerują, że zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej i adhezji mogą być zdarzeniami wczesnymi, które predysponują te komórki do efektów apoptotycznych.

Które czynniki transkrypcyjne kierują obserwowanymi zmianami?

Analiza wzbogacenia celów czynników transkrypcyjnych (TF) wykazała wzorce odpowiadające dawkowo-zależnym zmianom w ekspresji genów. Przy najniższej dawce (0,03 µg/L) wzbogacone były cele TF działających jako regulatory rozwojowe, w tym EGFR (NES = 1,93), SQSTM1 (1,91), ZMYND11 (1,90), HOXC13 (1,87) i RUVBL2 (1,76). Wiele z tych czynników kontroluje ekspresję genów zaangażowanych w różnicowanie neuronalne, adhezję i funkcję mitochondrialną.

Równocześnie obserwowano negatywne wzbogacenie dla represorów neuronalnych, takich jak BAHD1 (NES = -2,56), MYF6 (-2,52), SMCHD1 (-2,40), ZNF586 (-2,33) i ZNF418 (-2,29), co sugeruje promowanie rozwoju neuronalnego. Przy dawkach pośrednich (0,9 i 50 µg/L) wzorce TF były mniej wyraźne, ale obejmowały regulatory stresu i cyklu komórkowego oraz negatywne wzbogacenie represorów neuronalnych, takich jak NRSF_01 (NES = -2,57), FOXM1_01 (-2,22) i AHRARNT_01 (-2,20) przy 50 µg/L.

Najwyższa dawka (250 µg/L) wykazała przesunięcie w kierunku czynników związanych ze stresem i przeżywalnością, w tym HSF4 (NES = 2,05) oraz czynników palca cynkowego, wraz z negatywnym wzbogaceniem regulatorów rozwojowych, takich jak MSX2 (-2,25), MYF6 (-2,22), SMCHD1 (-2,11) i SOX11 (-2,04).

Chociaż żaden pojedynczy cel TF nie był wspólny dla wszystkich dawek, kilka genów neuronalnych (cdh2, grin1a, slc17a6b) pojawiało się wielokrotnie w różnych ekspozycjach na citalopram, co podkreśla ich centralną rolę w mechanizmach neurotoksyczności rozwojowej.

Czy zmiany wynikają z przesunięć w populacjach komórkowych?

Aby określić, czy obserwowane zmiany transkryptomiczne wynikają ze zmian w składzie typów komórkowych, przeprowadzono dekonwolucję pojedynczych komórek danych bulk RNA-seq z wykorzystaniem narzędzia MuSiC i referencyjnego atlasu rozwoju zebrafish (Atlas 1.0). Analiza obejmowała 45 unikalnych typów komórek obecnych przy 48 hpf.

Nie stwierdzono istotnych zmian w proporcjach żadnego typu komórkowego w odpowiedzi na którąkolwiek dawkę citalopramu po zastosowaniu korekty FDR. Analiza z użyciem surowych, nieskorygowanych wartości p sugerowała, że dawka 0,03 µg/L mogła wpłynąć na rzęskowane neurony rdzenia kręgowego (p = 0,018, p_adj = 0,279), komórki soczewki (p = 0,031), neutrofile (p = 0,039), neurony granicy środkowo-tylnego mózgu (p = 0,048) oraz komórki pąka płetwy (p = 0,048), jednak żadna z tych zmian nie osiągnęła istotności statystycznej po korekcji.

Te wyniki wskazują, że wczesne zaburzenie serotoninergiczne wpływa na programy transkrypcyjne w ramach stabilnych populacji komórek rozwojowych, a nie na skład linii komórkowych. Obserwowane różnice prawdopodobnie reprezentują trwałe przeprogramowanie regulacyjne, a nie efekty związane ze zmianą linii komórkowych, chociaż subtelne przesunięcia w rzadkich lub przejściowych populacjach mogą ujawnić się przy większych próbach.

Dlaczego odpowiedź na citalopram jest nieliniowa?

Nieliniowy wzorzec odpowiedzi, w którym najniższa dawka wywołuje największe zmiany, a dawki pośrednie najmniejsze, może wynikać z aktywności autoreceptorów serotoninowych. Są to wyspecjalizowane receptory na neuronie presynaptycznym, które wykrywają stężenie neuroprzekaźnika i inicjują ujemne sprzężenie zwrotne, zapobiegając dalszemu uwalnianiu serotoniny.

Podczas wczesnego rozwoju zebrafish (0–24 hpf) ekspresjonowane są geny kodujące receptory serotoniny, w tym autoreceptory 5-HT1A (hrt1aa i hrt1ab). Przy niskich stężeniach serotoniny niepełna aktywacja i brak desensytyzacji autoreceptorów 5-HT1A może pozwalać na silniejszą odpowiedź transkrypcyjną, podczas gdy wyższe dawki mogą uruchamiać silną aktywację autoreceptorów i kompensacyjne mechanizmy sprzężenia zwrotnego.

Oznacza to, że przy niskich dawkach serotoniny autoreceptory są tylko łagodnie aktywowane, więc synaptyczna serotonina pozostaje podwyższona; przy wyższych dawkach autoreceptory są silnie aktywowane, co prowadzi do zmniejszonej sygnalizacji serotoninergicznej. Aktywacja autoreceptorów zależna od dawki jest dodatkowo komplikowana przez desensytyzację, w której receptory stają się mniej responsywne na serotoninę w sposób zależny od dawki.

Przewlekła ekspozycja na wysokie dawki citalopramu może prowadzić do desensytyzacji autoreceptorów, przywracając uwalnianie serotoniny, co może wyjaśniać wzrost liczby DETs przy najwyższej dawce. Podobne bifazowe efekty opisano w odpowiedzi na opiaty i ołów oraz w innych badaniach nad citalopramu w odpowiedzi na różne dawki oraz ostrą i przewlekłą ekspozycję.

Co te odkrycia znaczą dla medycyny klinicznej?

Badanie dostarcza mocnych dowodów, że nawet krótkotrwała ekspozycja na citalopram w krytycznym okresie rozwoju może wywołać trwałe zmiany molekularne, które utrzymują się długo po zaprzestaniu kontaktu z lekiem. Co szczególnie istotne, efekty te występują przy dawkach odpowiadających stężeniom środowiskowym (0,03 µg/L), co sugeruje potencjalne ryzyko związane z zanieczyszczeniem wód powierzchniowych.

Dla praktyków klinicznych kluczowe jest zrozumienie, że “modulation of serotonin signaling during the first 24 h of development can alter neurodevelopmental pathways” – jak piszą autorzy badania. Chociaż dane pochodzą z modelu zebrafish, wysoka konserwacja procesów rozwojowych między rybami kostnoszkieletowymi a ssakami sugeruje potencjalną translacyjność tych ustaleń na rozwój ludzki.

Konsekwentna downregulacja genów synaptycznych i neurotransmisyjnych we wszystkich dawkach wskazuje na szczególną wrażliwość tych szlaków na zaburzenia serotoninergiczne. Zmiany te mogą leżeć u podstaw deficytów w formowaniu obwodów neuronalnych i plastyczności, potencjalnie oferując mechanistyczny wgląd w to, jak rozwojowa ekspozycja na SSRI prowadzi do późniejszych zmian neurobehawioralnych.

Ograniczenia badania obejmują brak oceny długoterminowych konsekwencji behawioralnych oraz konieczność ostrożnej ekstrapolacji danych z modelu rybiego na populację ludzką. Niemniej jednak, wyniki te podkreślają potrzebę dalszych badań nad bezpieczeństwem stosowania SSRI w okresie ciąży oraz nad potencjalnym wpływem zanieczyszczeń farmaceutycznych w środowisku na rozwój organizmu.

Jakie są najważniejsze wnioski z tego badania?

Krótkotrwała ekspozycja na citalopram podczas pierwszych 24 godzin rozwoju embrionalnego wywołuje trwałe, dawkowo-specyficzne zmiany w ekspresji genów u zebrafish, które utrzymują się nawet po 24-godzinnej przerwie bez kontaktu z lekiem. Nieliniowa odpowiedź dawkowa, z maksymalną liczbą zmian przy najniższej dawce środowiskowej (0,03 µg/L), sugeruje złożone mechanizmy regulacyjne prawdopodobnie związane z aktywnością autoreceptorów serotoninowych.

Niezależnie od dawki, konsekwentnie obserwowano downregulację genów związanych z architekturą synaptyczną i neurotransmisją, co wskazuje na szczególną wrażliwość tych szlaków. Równolegle, niskie dawki aktywowały szlaki metaboliczne związane z rozwojem neuronalnym, podczas gdy wysokie dawki indukowały odpowiedź stresową i procesy apoptotyczne. Istotne zmiany w genach związanych z rozwojem soczewki oka i macierzy zewnątrzkomórkowej sugerują szerokie konsekwencje rozwojowe dla morfogenezy tkanek.

Dekonwolucja pojedynczych komórek wykazała, że zmiany transkrypcyjne występują niezależnie od przesunięć w składzie typów komórkowych, co wskazuje na trwałe przeprogramowanie regulacyjne w ramach stabilnych populacji komórek rozwojowych. Badanie to podkreśla translacyjną wartość modelu zebrafish dla badania zaburzeń ludzkich związanych z zaburzonym formowaniem obwodów neuronalnych, metabolizmem i organizacją tkanek, oraz wskazuje na potrzebę ostrożności w stosowaniu SSRI podczas ciąży oraz monitorowania zanieczyszczeń farmaceutycznych w środowisku.