Immobilizacja enzymów: przełom w produkcji API dzięki nanowłóknom

Czy immobilizacja enzymów może zrewolucjonizować produkcję API?

Rosnące wymagania dotyczące zrównoważonych procesów chemicznych w przemyśle farmaceutycznym skłaniają do poszukiwania innowacyjnych rozwiązań zwiększających produktywność przy jednoczesnej minimalizacji wpływu na środowisko. Wolne enzymy, mimo wysokiej selektywności katalitycznej, charakteryzują się istotnymi ograniczeniami – niską stabilnością, brakiem możliwości ponownego wykorzystania oraz słabą odpornością na zmieniające się warunki środowiskowe. Te mankamenty szczególnie utrudniają ich zastosowanie w syntezie aktywnych substancji farmaceutycznych (API), gdzie kluczowa jest nie tylko wydajność, ale również enancjoselektywność reakcji.

Materiały hybrydowe, synergicznie łączące komponenty organiczne i nieorganiczne, wyłaniają się jako obiecujące podejście dzięki unikalnym i modyfikowalnym właściwościom. Struktury metalorganiczne (MOF) – porowate materiały zbudowane z jonów lub klastrów metali połączonych organicznymi ligandami – oferują bezprecedensową elastyczność projektowania na poziomie molekularnym. Możliwość precyzyjnego dostosowania właściwości poprzez modyfikację zarówno komponentu metalicznego, jak i organicznego, pozwala na kontrolę porowatości, rozmiaru i kształtu porów, hydrofilowości oraz obecności wymaganych grup funkcyjnych.

Dodatkowe możliwości optymalizacji właściwości katalitycznych oferuje połączenie MOF z cieczami jonowymi (IL) – tzw. “rozpuszczalnikami projektowalnymi”. Ciecze jonowe wyróżniają się znikomym ciśnieniem par, wysoką stabilnością chemiczną i termiczną oraz zdolnością do stabilizacji struktury czwartorzędowej enzymów. To sprawia, że immobilizowane z ich udziałem białka wykazują zwiększoną trwałość i odporność na ekstremalne wartości pH oraz temperatury, co ogranicza procesy denaturacji i umożliwia prowadzenie reakcji w warunkach destrukcyjnych dla wolnych enzymów.

Jak zaprojektowano innowacyjny system biokatalityczny?

Badacze opracowali nowatorski system oparty na elektrospinowanych nanowłóknach z polichlorku winylu (PVC) wzbogaconych strukturą metalorganiczną UiO-66-NH₂ jako nośnikiem dla immobilizacji lipazy z Candida sp. Wytworzono cztery typy mat: z PVC o niskiej (LOW PVC, MW = 40 kDa) i wysokiej (HIGH PVC, MW = 125 kDa) masie cząsteczkowej, zarówno bez dodatków, jak i z 3% (w/w) MOF względem suchej masy polimeru. Strukturę UiO-66-NH₂ otrzymano metodą solwotermiczną z chlorku cyrkonu(IV) i kwasu 2-aminotereftalowego w DMF z dodatkiem kwasu octowego jako modulatora krystalizacji, w temperaturze 120°C przez 24 godziny.

Proces elektrospinowania prowadzono przy przepływie roztworu 0,25 mL/h (dla mat z MOF) i 0,5 mL/h (dla czystego PVC), przy napięciu 12-13 kV. Immobilizację lipazy przeprowadzono w dwóch wariantach czasowych – 1 h i 24 h – z dodatkiem 5% wodnych roztworów chlorku choliny lub octanu choliny (25 μL). Końcowe systemy testowano pod kątem efektywności immobilizacji metodą Bradforda, aktywności katalitycznej przy użyciu palmitynianu paranitrofenylu (pNPP) jako substratu modelowego oraz stabilności termicznej i pH.

Kluczowym elementem badania była aplikacja najefektywniejszego systemu (HIGH PVC MOF-lip-CA) w reaktorze membranowym z recyrkulacją do enzymatycznej rozdzielczości racemicznego citalopramu. Reakcję prowadzono w acetonitrylu z octanem winylu jako donorem grupy acetylowej, przy przepływie 1 mL/min, monitorując postęp po 1, 8, 12 i 24 godzinach za pomocą HPLC z kolumną chiralną.

Jakie właściwości wykazały wytworzone nanowłókna?

Mikroskopia konfokalna (CLSM) potwierdziła wysoką jakość wytworzonych włókien – gęstą sieć nanostruktur z minimalną liczbą niedoskonałości. W przypadku mat z LOW PVC zaobserwowano obecność sferycznych obszarów będących efektem nieidealnymi warunkami elektrospinowania, podczas gdy włókna z HIGH PVC charakteryzowały się jednolitą, gładką strukturą. Tryb fluorescencyjny ujawnił skuteczną inkorporację cząstek MOF w strukturę włókien, przy czym HIGH PVC wykazywał większą liczbę jasnych inkluzji niż LOW PVC, co wskazuje na lepszą adhezję wyższocząsteczkowego polimeru do struktur metalorganicznych.

Analiza termograwimetryczna (TGA) wykazała, że najbardziej stabilnym termicznie materiałem okazała się mata z HIGH PVC z dodatkiem UiO-66-NH₂. Wpływ MOF na stabilność termiczną był bardziej widoczny dla HIGH PVC niż dla LOW PVC, co potwierdza efektywniejszą inkorporację struktury metalorganicznej w przypadku polimeru o wyższej masie cząsteczkowej. Test stabilności po zanurzeniu w buforze fosforanowym pH 7 przez 24 h nie wykazał istotnego wymywania MOF, co dokumentuje trwałość połączenia komponentów hybrydowych.

Pomiary potencjału zeta w zakresie pH 5-10 ujawniły, że wszystkie systemy z immobilizowanym enzymem charakteryzowały się ujemnymi wartościami potencjału elektrokinetycznego. Punkt izoelektryczny (IEP) dla wszystkich układów występował przy pH między 5 a 6. Systemy modyfikowane MOF wykazywały najlepszą stabilność elektrokinetyczną (potencjał zeta poniżej -30 mV) w najszerszym zakresie pH, od 7,5 do około 10, co koresponduje z danymi literaturowymi dotyczącymi membran modyfikowanych strukturami metalorganicznymi.

Które czynniki decydują o skuteczności immobilizacji?

Najwyższą efektywność immobilizacji, osiągającą 52%, uzyskano dla lipazy Candida sp. na macie HIGH PVC z dodatkiem MOF i octanu choliny. Inkorporacja struktury metalorganicznej zwiększyła adsorpcję enzymu dzięki dużej powierzchni właściwej UiO-66-NH₂ i obecności grup funkcyjnych ułatwiających przyłączanie białka. Dodatek cieczy jonowych wpłynął pozytywnie na efektywność poprzez stabilizację struktury enzymatycznej i zwiększenie powinowactwa enzymu do nośnika, tworząc korzystne mikrośrodowisko.

Octan choliny okazał się bardziej efektywny niż chlorek choliny, co wynika z wpływu pH roztworu na konformację enzymu i rozkład ładunku, modulujących powinowactwo białka do powierzchni nośnika. Lipaza wykazuje wyższą aktywność w środowisku zasadowym, podczas gdy chlorek choliny jest bardziej kwaśny niż octan choliny, co przekłada się na niższą aktywność katalityczną. Wydłużenie czasu immobilizacji z 1 h do 24 h pozytywnie wpłynęło na aktywność wszystkich testowanych systemów – wraz ze wzrostem liczby cząstek enzymu immobilizowanych na nośniku rosła jego aktywność biokatalityczna.

“Nasze wyniki pokazują, że optymalizacja zarówno nośnika, jak i warunków immobilizacji pozwala na uzyskanie systemów biokatalitycznych o parametrach przewyższających wolne enzymy” – podkreślają autorzy publikacji. Aktywność systemu HIGH PVC MOF-lip-CA była najwyższa spośród wszystkich testowanych wariantów, co potwierdza synergiczne działanie wysokocząsteczkowego polimeru, struktury metalorganicznej i cieczy jonowej.

W jakich warunkach system działa najefektywniej?

Badania wpływu temperatury wykazały, że immobilizowana lipaza osiągała najwyższą aktywność przy 50-60°C, znacznie przewyższając wolny enzym w całym badanym zakresie temperatur (20-60°C). Najaktywniejszym biokatalizatorem okazał się system HIGH PVC MOF przy 50°C. Wyższe temperatury zwiększały ruchliwość cząsteczek w roztworze, co podnosiło powinowactwo enzymu do substratu i efektywność reakcji. Materiały zawierające MOF i octan choliny wykazywały wyższą aktywność niż wolna lipaza w prawie wszystkich temperaturach, co wskazuje na ochronne działanie hydrofobowego mikrośrodowiska tworzonego przez ciecz jonową wokół centrum aktywnego lipazy.

Analiza wpływu pH ujawniła, że najwyższą aktywność biokatalityczną uzyskano przy pH 8, przy czym system HIGH MOF przewyższał pozostałe warianty. W środowisku lekko kwaśnym (pH 5) dodatek octanu choliny zwiększał aktywność immobilizowanego enzymu bardziej niż w przypadku wolnej lipazy, co wskazuje na ochronne działanie materiału nośnikowego. Immobilizowane systemy zachowywały charakterystyczną dla wolnej lipazy preferencję do środowiska zasadowego (pH 8-9), potwierdzając brak istotnych zmian strukturalnych enzymu podczas procesu immobilizacji.

Testy możliwości wielokrotnego użycia wykazały, że spadek aktywności biokatalizatora z każdym cyklem użycia był mniejszy dla systemów z dodatkiem cieczy jonowej niż bez niej. Dodatek octanu choliny podczas immobilizacji zwiększał stabilność uzyskanych systemów poprzez wzmocnienie wiązania enzymu z nośnikiem, co prawdopodobnie ograniczało wymywanie białka podczas kolejnych reakcji. Najmniejszy spadek aktywności – poniżej 10% po 5 cyklach – wykazał biokatalizator HIGH PVC MOF-lip-CA, demonstrując najwyższą możliwość wielokrotnego wykorzystania spośród wszystkich testowanych wariantów.

Jak długo system zachowuje aktywność katalityczną?

Testy stabilności przechowywania przez 30 dni w roztworze buforu fosforanowego pH 7 w temperaturze 4°C dostarczyły kluczowych informacji o długoterminowej integralności wytworzonych systemów biokatalitycznych. System HIGH PVC z dodatkiem UiO-66-NH₂ wykazał najwolniejszą utratę aktywności, zachowując po 30 dniach 80% początkowej aktywności, podczas gdy wolna lipaza CALB zachowała jedynie około 3% aktywności.

Duża powierzchnia właściwa struktury metalorganicznej umożliwiła immobilizację większej ilości enzymu, a jednocześnie utrudniała jego wymywanie z mat przechowywanych w roztworach wodnych. Nie tylko dodatek UiO-66-NH₂ wpływał na stabilność – również masa cząsteczkowa polimeru odgrywała istotną rolę. Biokatalizatory wykonane z HIGH PVC wykazywały większą stabilność niż te z LOW PVC, co wynika z większej wytrzymałości i powinowactwa włókien elektrospinowanych z wyższocząsteczkowego polimeru do enzymu. Związane jest to bezpośrednio z morfologią włókien – HIGH PVC charakteryzował się gładsza i bardziej jednolitą strukturą w porównaniu do LOW PVC, co prawdopodobnie spowalniało uwalnianie enzymu.

Szybka utrata aktywności wolnej CALB wynikała głównie z destabilizacji konformacyjnej w roztworze wodnym. Przechowywanie w 50 mM buforze fosforanowym bez dodatku stabilizujących substancji, takich jak poliole czy białka, prawdopodobnie prowadziło do stopniowego rozwijania struktury i agregacji. Jony fosforanowe mogą wchodzić w interakcje z naładowanymi resztami aminokwasowymi na powierzchni enzymu, subtelnie zmieniając jego równowagę elektrostatyczną i powłokę hydratacyjną, co może dodatkowo przyczyniać się do dryftu konformacyjnego i utraty formy aktywnej.

Czy system sprawdza się w syntezie farmaceutycznej?

Zastosowanie systemu HIGH PVC MOF-lip-CA w reaktorze membranowym z recyrkulacją do enzymatycznej rozdzielczości racemicznego citalopramu przyniosło obiecujące rezultaty. Citalopram wykazuje najsilniejsze działanie psychotropowe w formie S-enancjomeru, co czyni enancjoselektywną syntezę kluczowym wyzwaniem w produkcji tego leku. Po godzinie od rozpoczęcia reakcji konwersja S-citalopramu osiągnęła 19%, po 8 godzinach 50%, po 12 godzinach 76%, a po 24 godzinach 95%.

Kluczowym osiągnięciem była minimalna utrata R-citalopramu i znikoma ilość R-estru w końcowej próbce, demonstrująca wysoką enancjoselektywność i stereoselektywność zastosowanego systemu biokatalitycznego. Uzyskano enancjomeryczny nadmiar S-estru nad R-estrem przekraczający 93% przy 95% konwersji S-citalopramu. W całym badanym okresie konwersja R-citalopramu nie przekroczyła 8%, potwierdzając trafność wyboru szczepu enzymu do tej reakcji.

Stabilność enzymu w reaktorze membranowym z recyrkulacją została również oceniona – immobilizowana lipaza utrzymywała wysoką wydajność katalityczną przez cały proces, wykazując jedynie około 8% utraty początkowej aktywności po zakończeniu reakcji. Ten wynik potwierdza, że enzym pozostawał stabilny w warunkach reakcji, które często nakładają mechaniczne i dyfuzyjne naprężenia mogące prowadzić do dezaktywacji. Obserwowana stabilność wskazuje na silne interakcje enzym-nośnik oraz efektywną strategię immobilizacji zachowującą konformację i aktywność enzymu podczas długotrwałej operacji.

“Taka odporność jest kluczowym czynnikiem dla potencjalnych zastosowań przemysłowych, ponieważ zapewnia powtarzalność, efektywność kosztową i długoterminową stabilność operacyjną systemu biokatalitycznego” – podkreślają autorzy badania.

Co to oznacza dla zielonej syntezy farmaceutycznej?

Opracowany system biokatalityczny stanowi przełom w kontekście zrównoważonej produkcji aktywnych substancji farmaceutycznych. Połączenie elektrospinowanych mat z wysokocząsteczkowego PVC, struktury metalorganicznej UiO-66-NH₂ i octanu choliny jako cieczy jonowej stworzyło platformę charakteryzującą się wyjątkową kombinacją wysokiej efektywności immobilizacji (52%), pełnego odzysku aktywności (100%) oraz szerokiego zakresu operacyjnego w zakresie pH (8-9) i temperatury (50-60°C).

System wykazał przewagę nad wolnymi enzymami w każdym testowanym aspekcie – stabilności termicznej, odporności na zmiany pH, możliwości wielokrotnego użycia oraz stabilności przechowywania. Po 30 dniach przechowywania zachował 80% aktywności w porównaniu do zaledwie 3% dla wolnej lipazy. Po pięciu cyklach reakcji utrata aktywności nie przekroczyła 10%, co dokumentuje praktyczną przydatność systemu do wielokrotnego wykorzystania. W reaktorze membranowym system utrzymał wysoką wydajność przez 24 godziny, tracąc jedynie 8% początkowej aktywności.

Kluczowym osiągnięciem była demonstracja zastosowania systemu w enancjoselektywnej rozdzielczości racemicznego citalopramu, gdzie uzyskano 93% enancjomerycznej czystości przy 95% konwersji S-citalopramu. To konkretny przykład translacji rozwiązania laboratoryjnego na aplikację o potencjale przemysłowym, zgodną z zasadami zielonej chemii. Enzymatyczna synteza eliminuje potrzebę stosowania toksycznych reagentów chemicznych i ekstremalnych warunków reakcji charakterystycznych dla tradycyjnych metod syntezy chiralnych związków farmaceutycznych.

Masa cząsteczkowa polimeru została zidentyfikowana jako krytyczny czynnik wpływający na trwałość włókien i efektywność immobilizacji – wyższe masy cząsteczkowe poprawiały oba te parametry. To wskazuje na możliwość dalszej optymalizacji systemu poprzez dobór odpowiednich materiałów polimerowych. Integracja projektowania nośnika wzbogaconego MOF, stabilizacji enzymu za pomocą cieczy jonowej i technologii reaktora membranowego tworzy skalowalne, ekologiczne rozwiązanie alternatywne wobec tradycyjnych procesów chemicznych w produkcji leków.

Jakie są perspektywy wdrożenia technologii?

Przedstawione badanie dostarcza solidnych podstaw do rozważenia przemysłowego zastosowania opracowanego systemu biokatalitycznego w produkcji enancjomerycznie czystych aktywnych substancji farmaceutycznych. Połączenie wysokiej efektywności katalitycznej, stabilności operacyjnej i możliwości wielokrotnego użycia spełnia kluczowe wymagania procesów przemysłowych. System wykazał niezawodność w reaktorze membranowym, co jest istotne z perspektywy skalowania procesu. Niemniej jednak, translacja wyników z poziomu laboratoryjnego do zastosowań przemysłowych wymaga dalszych badań. Mimo ograniczeń wynikających z charakteru eksperymentalnego in vitro, opracowane rozwiązanie wpisuje się w globalny trend dążenia do zrównoważonych procesów produkcyjnych w przemyśle farmaceutycznym. System może znaleźć zastosowanie nie tylko w produkcji citalopramu, ale również innych chiralnych związków aktywnych, gdzie enancjoselektywność jest krytyczna dla skuteczności i bezpieczeństwa terapii.